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          谷胱甘肽琼脂糖凝胶使用说明

          点击次数:2907 发布时间:2011/4/22
          提 供 商: 上海锐谷生物科技有限公司 资料大小:
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          详细介绍:

          Pgex载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶溶合,因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。Pgex是一类以谷胱甘肽(γ-谷胱甘肽半胱胺酰甘氨酸)作为底物,通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚豪摩尔级的,因此谷胱甘肽固化琼脂糖形成的亲和层析树脂GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。
          谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强(每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白)。
          谷胱甘肽树脂的处理
          1. 轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器,将树脂混成匀浆
          2. 取部分匀浆放入15ml聚丙烯管(每100ml 细菌培养物需要2ml匀浆)
          3. 4℃ 500 g离心5分钟,小心去掉上清。
          4. 在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次,混合均匀,4℃ 500 g离心5分钟,小心去掉上清。
          5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS,制成50%匀浆,颠倒数次,混合均匀,悬液冰上放置待用
          制备细胞抽提物
          6. 每100毫升培养基的细胞沉淀悬于4mlPBS
          7. 加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30分钟
          8. 用针筒将10ml 0.2%TritonX-100 强行注入黏的细胞裂解物中,剧烈振动数次均匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃振动温育10分钟,4℃3000g离心30分钟,去除不溶性细胞碎片,上清转移到一只新管中,加入DTT至终浓度1mmol/L
          纯化融合蛋白
          9. 细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合,每100毫升细菌培养物加2ml树脂,于室温轻摇30min
          10. 混合物于4℃以500g离心5分钟,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
          11. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒离心管数次混匀,洗去未与树脂结合的蛋白。
          12. 4℃以500g离心5分钟,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
          13. 重复步骤11和12两次
          14. 合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱,也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割,
          用谷胱甘肽洗脱融合蛋白
          a. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液,室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白。
          b. 如步骤12离心,上清(含洗脱的融合蛋白)移至管中。
          c. 重复步骤a和b,合并三次上清。
          蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上挥手靶蛋白
          a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择),每ml树脂加入50单位溶于1mlPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀,室温下振荡2-16小时。用小规模试验确定精确时间。
          b. 4℃以500g离心5分钟,上清小心移至新管中。(GST仍结合在树脂上,而靶蛋白也在上清中,仍需要奋力)
          15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成
          试剂配制
          谷胱甘肽洗脱缓冲液:10mmol/L还原型谷胱甘肽
          50mmol/L Tris-Cl(PH8.0)
           

           
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